REPLI-g單細胞試劑盒

REPLI-g單細胞試劑盒

從單個(gè)細胞或有限的樣品材料中進(jìn)行高度均勻的全基因組擴增（WGA）

• 單細胞材料的WGA具有完整的基因組覆蓋范圍
• 由于MDA技術(shù)，基因組基因座的無(wú)偏擴增
• 經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可與包括NGS在內的新技術(shù)配合使用
• 一致的產(chǎn)量高達40 µg（平均產(chǎn)物長(cháng)度> 10 kb）
• 用于癌癥研究，干細胞研究或宏基因組學(xué)的新型工具

使用創(chuàng )新儀器（例如下一代測序（NGS）平臺）進(jìn)行生物樣品的DNA序列分析和基因分型通常受限于少量樣品。REPLI-g單細胞試劑盒專(zhuān)門(mén)設計用于從單細胞（1至<1000個(gè)細菌或腫瘤細胞）或純化的基因組DNA中均勻擴增基因組DNA，并具有完整的基因組覆蓋范圍。其他協(xié)議也可用于新鮮或干燥血液或新鮮或冷凍組織。的緩沖液和試劑經(jīng)過(guò)*的受控去污程序，以避免擴增污染性DNA，從而確保每次都獲得高度可靠的結果。創(chuàng )新的多重置換擴增（MDA）技術(shù)可實(shí)現具有可忽略的序列偏倚且無(wú)基因組缺失的基因組準確擴增。

REPLI-g單細胞試劑盒

REPLI-g單細胞試劑盒適用于分子生物學(xué)應用。本產(chǎn)品不用于診斷，預防或治療疾病。

產(chǎn)品詳情

性能

完整的基因組覆蓋范圍，非常適合NGS和其他下游應用

使用REPLI-g單細胞試劑盒擴增的DNA的平均產(chǎn)物長(cháng)度> 10 kb，并具有大的基因組覆蓋范圍。它已通過(guò)眾多下游分析進(jìn)行了測試，并非常適用于這些分析，包括下一代測序（NGS），陣列比較基因組雜交（aCGH）和基于實(shí)時(shí)PCR的應用（請參見(jiàn)表2）。由于不需要單獨的基于PCR的擴增步驟，因此與基于PCR的方法相比，REPLI-g全基因組擴增和文庫制備所需的動(dòng)手時(shí)間更少，讀取長(cháng)度更長(cháng)（請參見(jiàn)“使用與基于PCR的方法相比，REPLI-g擴增的DNA需要更少的動(dòng)手時(shí)間并產(chǎn)生更多的序列信息“）。高質(zhì)量的，可比的NGS結果表明，純化的基因組DNA或REPLI-g單細胞擴增的DNA均可實(shí)現高百分比的序列覆蓋率和非常低的錯誤率，包括僅從單個(gè)細菌細胞開(kāi)始的情況（見(jiàn)圖） “可比NGS結果”）。這些發(fā)現是通過(guò)寬范圍的標記覆蓋所有人類(lèi)常染色體和X染色體的全面分析強調，具有3個(gè)不同的獨立的實(shí)驗表明DNA被成功地從基因組的所有區域擴增無(wú)單次輟學(xué)（見(jiàn)圖“完整的基因組覆蓋范圍”）。

REPLI-g單細胞試劑盒優(yōu)于其他供應商的試劑盒

其他供應商通常使用的基于PCR的WGA方法導致短片段被PCR引物序列終止，這可能會(huì )影響下游過(guò)程（例如，下一代測序；請參見(jiàn)圖“使用REPLI-g擴增的DNA進(jìn)行的下一代測序需要更少的動(dòng)手時(shí)間，比基于PCR的方法產(chǎn)生更多的序列信息”）?；赑CR的WGA可能導致容易出錯的擴增，例如，導致單個(gè)堿基對突變，STR收縮和擴增，并且由于使用低保真酶Taq而導致基因座的偏倚和代表性不足DNA聚合酶。相比之下，REPLI-g單細胞試劑盒可在整個(gè)基因組中提供高度均勻的擴增，且擴增過(guò)程中基因座偏向小。使用每種試劑盒*的單細胞擴增方案，測試了四種WGA試劑盒（包括REPLI-g單細胞試劑盒）和2種利用MDA技術(shù)的2種基于PCR的方法的序列表示和基因座缺失。與REPLI-g單細胞試劑盒不同，使用其他供應商的試劑盒分析的單細胞通常無(wú)法完整無(wú)偏地顯示序列（請參見(jiàn)“從單細胞無(wú)偏DNA擴增”圖）。

原理

REPLI-g單細胞試劑盒包括REPLI-g sc聚合酶，這是創(chuàng )新的高保真酶Phi 29聚合酶的優(yōu)化配方，可使用多重置換擴增（MDA）技術(shù)擴增復雜的基因組DNA，并進(jìn)行溫和的堿性孵育以確保非常低的DNA/片段化或無(wú)堿基位點(diǎn)的產(chǎn)生。它經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)設計，可從單個(gè)細胞（例如分離的腫瘤細胞或細菌）提供高產(chǎn)量的擴增DNA（請參見(jiàn)表1）。此外，它還可以用于各種臨床和非臨床研究樣品以及純化的基因組DNA，同時(shí)還可以使用其他方案來(lái)處理新鮮或干燥的血液以及新鮮或冷凍的組織。無(wú)論模板的起始量如何，典型的DNA產(chǎn)量始終可達到40 µg，這意味著(zhù)隨后的遺傳分析無(wú)需進(jìn)一步測量DNA濃度即可進(jìn)行。平均產(chǎn)物長(cháng)度超過(guò)10 kb，并且具有完整的基因組覆蓋范圍，確保使用REPLI-g單細胞試劑盒擴增的DNA非常適合眾多下游應用，包括下一代測序（NGS），基于陣列的比較基因組雜交（陣列CGH） ），焦磷酸測序和實(shí)時(shí)PCR分析（表2）。

放大原理

REPLI-g單細胞試劑盒使用等溫基因組擴增，稱(chēng)為多重置換擴增（MDA），涉及隨機六聚體與變性DNA的結合，然后在恒定溫度下用優(yōu)化形式的Phi 29聚合酶進(jìn)行鏈置換合成，它具有異常強的股線(xiàn)位移特性。在每條置換的鏈上都可充當模板，從而引發(fā)額外的引發(fā)事件，從而可產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴增DNA（見(jiàn)圖“多重置換擴增（MDA）技術(shù)”）。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生的酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對活性）的DNA聚合酶，其保真度比Taq高1000倍DNA聚合酶。在*，優(yōu)化的REPLI-g單細胞緩沖液系統的支持下，Phi 29聚合酶可以輕松解決二級結構（如發(fā)夾環(huán)），從而防止擴增過(guò)程中聚合酶的滑動(dòng)，終止和解離。這樣就可以產(chǎn)生高達100 kb的DNA/片段，而不會(huì )產(chǎn)生序列偏倚（請參見(jiàn)“用Phi 29聚合酶進(jìn)行無(wú)偏擴增”）。

DNA的細胞裂解和堿變性

在用于酶促擴增程序之前，必須先對基因組DNA進(jìn)行變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在高溫下孵育（熱孵育）或在pH值升高（化學(xué)堿性孵育）的情況下。REPLI-g單細胞試劑盒使用溫和的堿性孵育，可實(shí)現gDNA的細胞裂解和均勻的DNA變性，而DNA/片段化程度極低或無(wú)堿基位點(diǎn)的產(chǎn)生。這導致擴增的DNA具有非常高的完整性，并大化了擴增片段的長(cháng)度，因此基因組位點(diǎn)和序列被均勻地表示（參見(jiàn)“熱和堿變性對位點(diǎn)表示的影響”圖）。

有效消除可檢測的DNA污染

所有REPLI-g單細胞試劑盒組件均經(jīng)過(guò)*的受控去污程序，以確保消除所有REPLI-g可擴增的污染DNA。通過(guò)創(chuàng )新和標準化的程序將緩沖液和試劑暴露在紫外線(xiàn)輻射下，以確保不存在任何可檢測到的殘留污染性DNA（請參見(jiàn)“創(chuàng )新性去污程序”圖）。經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)處理后，套件會(huì )進(jìn)行嚴格的質(zhì)量控制，以確保完整的功能。

程序

簡(jiǎn)單的一管程序

REPLI-g單細胞試劑盒使用簡(jiǎn)單可靠的方法從單細胞或有限樣品中獲得準確的基因組擴增。簡(jiǎn)單的反應設置和非常短的處理時(shí)間（約15分鐘）使這成為一種簡(jiǎn)單而可靠的方法（請參見(jiàn)“ REPLI-g單細胞試劑盒程序”圖）。已開(kāi)發(fā)出的緩沖液和試劑，可從單個(gè)細胞，有限的組織材料和純化的DNA中獲得高產(chǎn)量的DNA，并具有完整的序列表示和無(wú)偏擴增（表3）。REPLI-g擴增的DNA可以在–20°C下長(cháng)期保存，不會(huì )產(chǎn)生負面影響（請參見(jiàn)“一致的長(cháng)期穩定性”圖）。